限制酶主要作用于DNA双链骨架中的磷酸二酯键。它通过识别双链DNA上的特异序列,在识别序列内部或靠近识别序列的位置催化切割磷酸二酯键,让脱氧核苷酸之间的骨架产生切口,并形成黏性末端或平末端。在常见教材和基因工程场景中,当问到限制酶作用于什么键时,答案可直接指向磷酸二酯键。